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As análises microbiológicas em alimentos

Como devem ser utilizados os homogeneizadores, liquidificadores e misturadores? O que permite executar com uma autoclave? Como devem ser usados o refrigerador ou a câmara fria? Por que é importante ter um banho termostático controlado? Para que serve uma estufa de esterilização? Como utilizar o bico de gás ou incinerador de alças metálicas? Essas perguntas estão sendo respondidas no texto sobre as orientações para análises microbiológicas em alimentos.

19/06/2019 - Equipe Target

NBR ISO 7218 de 06/2019: as orientações para análises microbiológicas em alimentos

A NBR ISO 7218 de 06/2019 - Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal — Requisitos gerais e orientações para análises microbiológicas fornece os requisitos gerais e as orientações/opções destinadas a três usos principais: implementação das normas do ISO/TC 34/SC 9 ou ISO/TC 34/SC 5 para detecção ou enumeração de microrganismos, denominado a seguir “normas específicas”; boas práticas de laboratório para os laboratórios de microbiologia de alimentos (o objetivo não é detalhar nesta norma, os manuais estão disponíveis para esta finalidade); orientação para acreditação de laboratórios de microbiologia de alimentos (esta norma descreve os requisitos técnicos de acordo com a ISO/IEC 17025:2005, Anexo B, para acreditação de um laboratório microbiológico por organizações nacionais).

Os requisitos desta norma substituem os correspondentes das normas específicas existentes. Instruções adicionais sobre ensaio envolvendo biologia molecular são especificadas na ISO 22174. Abrange os ensaios de bactérias, leveduras e bolores, e pode ser usada se suplementada com orientação específica para prions, parasitas e vírus. Ela não abrange o ensaio para toxinas ou outros metabolitos (por exemplo, aminas) de microrganismos.

Esta norma é aplicável à microbiologia de alimentos de consumo humano e animal, ao ambiente de produção de alimentos e ao ambiente de produção primária. O seu objetivo é auxiliar a assegurar a validade dos ensaios de microbiologia de alimentos, para ajudar a assegurar que as técnicas gerais utilizadas para a realização destes ensaios sejam as mesmas em todos os laboratórios, para ajudar a alcançar resultados homogêneos em diferentes laboratórios e contribuir para a segurança do pessoal de laboratório, evitando riscos de infecção.

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Como devem ser utilizados os homogeneizadores, liquidificadores e misturadores?

O que permite executar com uma autoclave?

Como devem ser usados o refrigerador ou a câmara fria?

Por que é importante ter um banho termostático controlado?

Para que serve uma estufa de esterilização?

Como utilizar o bico de gás ou incinerador de alças metálicas?

Ao realizar análises microbiológicas, é especialmente importante que: apenas os microrganismos que estão presentes nas amostras sejam isolados e enumerados; os microrganismos não contaminem o ambiente. A fim de conseguir isso, é necessário prestar atenção à higiene pessoal e usar técnicas de trabalho que assegurem, na medida do possível, a exclusão de contaminantes.

Uma vez que, nesta norma, é possível apenas exemplificar as precauções a serem tomadas durante as análises microbiológicas, um conhecimento profundo das técnicas microbiológicas e dos microrganismos envolvidos é essencial. É importante que os ensaios sejam realizados com a maior precisão possível, incluindo aspectos de controle e de registro, que podem afetar os resultados e o cálculo do número de microrganismos e a incerteza dos resultados.

Em última análise, é da responsabilidade do líder do laboratório julgar se as manipulações são seguras e se podem ser consideradas boas práticas de laboratório. Um grande número de manipulações pode, por exemplo, levar à contaminação cruzada não intencional, e convém que o analista sempre verifique a precisão dos resultados obtidos por sua técnica. A fim de realizar os ensaios corretamente, é necessário tomar certas precauções ao construir e equipar o laboratório.

Certas precauções devem ser tomadas, não só por razões de higiene, mas também para assegurar uma boa reprodutibilidade dos resultados. Não é possível especificar todas as precauções a serem tomadas em todas as circunstâncias, mas esta norma pelo menos fornece as principais medidas a serem tomadas quando da preparação, esterilização, armazenamento de meios e uso de equipamento.

O projeto do laboratório deve estar em conformidade com os requisitos de segurança, que dependem do tipo de microrganismo. Para este fim, os microrganismos são classificados em quatro categorias de risco. Na categoria de risco 1 (muito baixo ou nenhum risco para o indivíduo e para a comunidade), um microrganismo que é improvável causador de doença humana ou animal.

Na categoria de risco 2 (risco moderado para o indivíduo, baixo risco para a comunidade), um agente patogênico que pode causar doenças em humanos ou em animais, mas que é improvável que represente perigo grave aos funcionários do laboratório, à comunidade ou ao ambiente. Exposições laboratoriais podem causar infecção humana grave, mas tratamento eficaz e medidas preventivas estão disponíveis, e o risco de propagação da infecção é limitado.

Na categoria de risco 3 (alto risco para o indivíduo, baixo risco para a comunidade), um agente patogênico que geralmente causa doenças graves em humanos ou em animais, mas que normalmente não é transmitido de um indivíduo infectado para outro. Tratamento eficaz e medidas preventivas estão disponíveis. Na categoria de risco 4 (alto risco para o indivíduo e para a comunidade), um agente patogênico que geralmente causa doenças graves em humanos ou animais, que podem ser rapidamente transmitidas a partir de um indivíduo para outro, direta ou indiretamente. Tratamento eficaz e medidas preventivas geralmente não estão disponíveis.

O objetivo é assegurar que o ambiente dentro do qual as análises microbiológicas são realizadas não afete a confiabilidade dos resultados do ensaio. Providenciar dependências de forma a evitar o risco de contaminação cruzada. Maneiras de atingir este objetivo são, por exemplo: construir o laboratório de acordo com o princípio do leiaute “sem retorno”; realizar procedimentos de forma sequencial, utilizando as devidas precauções para assegurar a integridade do ensaio e da amostra (por exemplo, uso de recipientes fechados); separar as atividades por tempo ou espaço.

Evitar condições extremas, como temperatura excessiva, poeira, umidade, vapor, ruído, vibração etc. Convém que o espaço seja suficiente para permitir que as áreas de trabalho sejam mantidas limpas e arrumadas.

Convém que o espaço necessário seja proporcional ao volume de análises e à organização interna global do laboratório. Convém que o espaço seja regulado por legislação nacional, quando existir. Convém que as instalações sejam construídas e equipadas a fim de reduzir o risco de contaminação por poeira e, portanto, por microrganismos (para microrganismos da categoria de risco 3, verificar a legislação nacional).

Convém que as paredes, tetos e pavimentos sejam lisos, fáceis de limpar e resistentes a detergentes e desinfetantes usados em laboratórios. Convém que o piso seja antiderrapante. Convém que as tubulações aéreas de transporte de líquidos não cruzem as dependências, a menos que sejam hermeticamente fechadas. Convém que qualquer outra estrutura aérea seja coberta ou facilmente acessível para limpeza regular.

Convém que as janelas e portas sejam fechadas durante a realização dos ensaios, a fim de minimizar correntes de ar. Além disso, convém que estas sejam construídas de modo a evitar a formação de depósitos de poeira, assim facilitando a sua limpeza. Convém que a temperatura ambiente (18 °C a 27 °C) e a qualidade do ar (conteúdo de microrganismos, taxa de espalhamento de poeira etc.) sejam compatíveis com a realização dos ensaios.

Um sistema de ventilação de ar filtrado de entrada e de saída é recomendado para esta finalidade. Convém que um sistema de extração adequado seja instalado para evitar a exposição às poeiras provenientes do manuseio de meios de cultura desidratados e das amostras em pó. Quando os ensaios forem realizados em uma atmosfera de baixa contaminação, convém que a sala seja especialmente equipada com uma cabine de fluxo laminar e/ou cabine de segurança biológica.

Para cada método ou técnica, critérios objetivos devem ser estabelecidos para a avaliação das competências adequadas, tanto inicialmente como em base contínua. A competência pode ser estabelecida dentro do laboratório por controle interno de qualidade (ver 15.1.2). Um dos meios de investigar a causa de desempenho deficiente (pipetagem, erro na homogeneidade da suspensão inicial, contagem, etc.), no caso de contagem por enumerações de colônias, é encontrado na ISO 14461-1.

Convém que a verificação continuada de competência do pessoal seja realizada regularmente com parâmetros objetivos. Isso inclui a participação em programas internos de garantia da qualidade, ensaios de proficiência (ver ISO/IEC Guide 43-1), uso de materiais de referência ou avaliação interna por meio de ensaios para enumeração de microrganismos, como descrito na ISO 14461-2. Devem ser tomadas algumas precauções de higiene pessoal para evitar a contaminação das amostras e meios de cultura e para prevenir o risco de infecção do pessoal.

Usar vestuário de laboratório devidamente fechado, limpo e em boas condições, feitos com tecido que limite os riscos de inflamabilidade. Esta roupa não pode ser usada fora das áreas de trabalho e, incluindo, se possível, vestiários. Se necessário, para a integridade da amostra, usar proteção para cabelos e barba. Manter as unhas limpas e de preferência curtas. Lavar bem as mãos em água morna, de preferência em torneira não acionada manualmente, antes e após as análises microbiológicas e imediatamente após ir ao banheiro.

Usar sabão líquido ou em pó ou, se possível, sanitizante, disponibilizado preferencialmente em dispensador mantido em condições de limpeza. Para a secagem das mãos, usar toalhas de papel ou de pano descartáveis. Estas precauções são aplicáveis tanto aos funcionários do laboratório quanto aos visitantes. Ao trabalhar com amostras, culturas e meios expostos, e ao inocular, evitar falar, tossir, etc.

As pessoas portadoras de infecções de pele ou de doenças devem tomar precauções, pois os microrganismos presentes podem contaminar as amostras e invalidar os resultados. Não comer ou beber no laboratório e não colocar alimentos para consumo pessoal em refrigeradores ou freezers do laboratório. É proibido pipetar com a boca. De acordo com as boas práticas de laboratório, convém que todos os materiais e equipamentos sejam mantidos limpos e em boas condições de funcionamento. Antes da utilização, convém verificar se o equipamento está adequado à finalidade pretendida e se o seu desempenho é monitorado durante a utilização, quando apropriado.

Quando necessário, convém que os equipamentos e dispositivos de monitoramento sejam calibrados de acordo com padrões nacionais rastreáveis, e que a recalibração e quaisquer verificações intermediárias necessárias sejam executadas, bem como os procedimentos e resultados documentados. Convém que o equipamento seja regularmente verificado e mantido para assegurar a segurança e adequação ao uso. Convém que o equipamento seja monitorado de acordo com as condições de trabalho e a exatidão requerida para os resultados.

A frequência de calibração e de verificação de cada item do equipamento é, na maioria dos casos, não especificada nesta norma, uma vez que deve ser determinada por cada laboratório, dependendo do tipo de equipamento e do nível de atividade do laboratório, de acordo com as instruções do fabricante. Em um número limitado de casos, uma frequência foi especificada, desde que foi considerada essencial. Os materiais e equipamentos devem ser construídos e instalados de forma a facilitar a operação e permitir a facilidade de manutenção, limpeza, descontaminação e calibração.

Qualquer incerteza de medição indicada nesta Seção refere-se aos materiais e equipamentos relacionados e não a todo os métodos de análise. Em toda esta Seção, são fornecidos os requisitos para a exatidão do equipamento de medição. Estes são baseados no erro prático necessário para demonstrar o controle adequado do equipamento na utilização de rotina. A exatidão indicada está relacionada à incerteza metrológica do dispositivo (ver ISO/IEC Guide 99).

Para o equipamento de controle de temperatura, verificar a estabilidade e a homogeneidade da temperatura antes do primeiro uso e após qualquer reparo ou modificação que possa ter um efeito sobre o controle da temperatura. Uma cabine de segurança é uma estação de trabalho com fluxo de ar laminar horizontal ou vertical para remover a poeira e outras partículas, como microrganismos do ar. O número máximo tolerável de partículas por metro cúbico com uma dimensão superior ou igual a 0,5 μm representa a classe de espalhamento de poeiras de uma cabine de segurança.

Para as cabines utilizadas na microbiologia de alimentos, o número de partículas não pode exceder 4.000 por metro cúbico. Cabines de segurança para uso em laboratórios de microbiologia de alimentos são de quatro tipos. Cabines de biossegurança Classe I são cabines de proteção com abertura frontal destinada a proteger o operador e o ambiente, mas não protegem o produto da contaminação externa.

Os aerossóis potencialmente infectados serão contidos dentro da cabine e presos por impactação no filtro. O ar filtrado é normalmente descarregado para a atmosfera. Se isso não for feito, o ar deve passar através de dois filtros de alta eficiência de partículas de ar (HEPA), montados em série. Estes não são recomendados para o trabalho com agentes patogênicos da categoria de risco 3, devido às dificuldades para manter e assegurar a proteção adequada do operador.

Cabines de biossegurança Classe II protegem o produto, o operador e o ambiente. Elas recirculam um pouco de ar filtrado, sendo um pouco expulso para a atmosfera, e recebem ar de substituição pela abertura de trabalho, proporcionando assim a proteção do operador. Elas são adequadas para o trabalho com categoria de patógenos de risco 2 e 3.

Cabines de fluxo laminar horizontal protegem o trabalho da contaminação, mas sopram quaisquer aerossóis gerados na face do operador. Portanto, elas não são adequadas para manipular culturas inoculadas ou para preparar cultura de tecidos. Cabines de fluxo de ar laminar vertical protegem o produto pelo uso de fluxo laminar vertical de ar filtrado com HEPA. Elas também protegem o operador pelo uso de ar recirculado internamente.

Elas são particularmente adequadas para proporcionar um ambiente asséptico, para manusear produtos estéreis e para proteger o operador ao manusear pós. Utilizar cabines de biossegurança para todos os trabalhos que envolvam a manipulação de agentes patogênicos e pós contaminados, se requerido pelos regulamentos nacionais. O uso de bicos de gás ou incinerador de alças metálicas não é recomendado em cabines de proteção.

Se for necessário, convém que o bico de gás tenha uma chama pequena para que o fluxo de ar não seja perturbado. A utilização de instrumentais descartáveis (alças, pipetas, etc.) é uma alternativa adequada. Utilizar cabines de biossegurança que sejam apropriadas para a aplicação pretendida e para as condições ambientais no laboratório. Convém que as cabines sejam mantidas o mais livre possível de instrumentais.

Quando praticável, colocar tudo que for necessário dentro da cabine antes de iniciar o trabalho, para minimizar o número de movimentos do braço dentro e fora da abertura de trabalho. Posicionar o equipamento e os materiais de forma a minimizar a perturbação do fluxo de ar na abertura de trabalho. As balanças são utilizadas principalmente para pesar a alíquota de ensaio da amostra a ser analisada e os componentes dos meios de cultura e reagentes.

Além disso, podem ser utilizadas para efetuar medições dos volumes de fluido de diluição em massa. Os diluidores gravimétricos são instrumentos eletrônicos constituídos por uma balança e um distribuidor de líquidos programável e são utilizados durante a preparação das suspensões iniciais da amostra. Eles funcionam por adição de diluente a uma subamostra, a uma razão definida.

A subamostra é então pesada no erro especificado na aplicação e o diluente é ajustado para distribuir quantidade suficiente para a razão requerida (por exemplo, 9 para 1 para diluições decimais). Ver ISO 6887-1. Um laboratório de microbiologia de alimentos deve estar equipado com balanças da escala requerida e incerteza de medição para os diferentes produtos a serem pesados.

FONTE: Equipe Target

Baseado nos documentos visitados

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