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A detecção e a enumeração de E. coli em águas superficiais e residuais

Como deve ser feita a incubação na placa para microtitulação? Como deve ser feito o cálculo do número mais provável (NMP) e seu intervalo de confiança? Qual é a composição iônica principal de um sal marinho sintético conveniente? Quais são as características de desempenho do método? Essas indagações estão sendo dirimidas na NBR ISO 9308-3 de 11/2021 - Qualidade da água — Detecção e enumeração de Escherichia coli e bactérias coliformes - Parte 3: Método miniaturizado (número mais provável) para a detecção e enumeração de E. coli em águas superficiais e residuais.

22/12/2021 - Equipe Target

NBR ISO 9308-3 de 11/2021 - Qualidade da água — Detecção e enumeração de Escherichia coli e bactérias coliformes - Parte 3: Método miniaturizado (número mais provável) para a detecção e enumeração de E. coli em águas superficiais e residuais

A NBR ISO 9308-3 de 11/2021 - Qualidade da água — Detecção e enumeração de Escherichia coli e bactérias coliformes - Parte 3: Método miniaturizado (número mais provável) para a detecção e enumeração de E. coli em águas superficiais e residuais especifica um método miniaturizado para a detecção e enumeração de Escherichia coli (E. coli) em águas superficiais e residuais por inoculação em meio líquido. O método é aplicável a todos os tipos de águas superficiais e residuais, especialmente aquelas ricas em matéria em suspensão.

Este método não é adequado para água potável e qualquer outro tipo de água para a qual a diretriz seja para contagens inferiores a 15 mL por 100 mL. Este método não é apropriado para a enumeração e detecção de bactérias coliformes diferentes de E. coli. A Escherichia coli é um microrganismo positivo para 1-D-glucuronidase, crescendo a uma temperatura de incubação de 44 °C, no meio líquido especificado contendo 4-metilumbeliferil-1-D-glucuronídeo (MUG).

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Como deve ser feita a incubação na placa para microtitulação?

Como deve ser feito o cálculo do número mais provável (NMP) e seu intervalo de confiança?

Qual é a composição iônica principal de um sal marinho sintético conveniente?

Quais são as características de desempenho do método?

A amostra diluída é inoculada em uma fileira de poços de placas de microtitulação contendo meio de cultura desidratado. As placas de microtitulação são examinadas sob luz ultravioleta a 366 nm no escuro, após um período de incubação de 36 h no mínimo e 72 h no máximo, a 44 °C ± 0,5 °C. A presença de E. coli é indicada por uma fluorescência azul, resultante da hidrólise de MUG. Os resultados são apresentados como número mais provável (NMP) por 100 mL.

Como aparelhagem, com exceção do material fornecido esterilizado, a vidraria deve ser esterilizada de acordo com as instruções fornecidas na ISO 8199. Usam-se os materiais usuais de laboratório microbiólogico, e em particular: um equipamento para esterilização por calor seco (forno) ou por calor úmido (autoclave); uma incubadora termostática regulada para 44 °C ± 0,5 °C; uma cabine de fluxo laminar (preferencialmente classe II) ou secador de túnel; e uma câmara de observação UV (lâmpada de Wood, de 366 nm).

Deve-se observar que a luz UV causa irritação nos olhos e pele. Usar óculos de proteção e luvas. Deve-se incluir um refratômetro portátil (opcional) e peagômetro com exatidão de ± 0,1.

O equipamento medidor de pH, denominado “peagômetro”, é conhecido também no meio técnico pelo jargão “peagâmetro”. Usar os tubos de ensaio com dimensões de 16 mm × 160 mm e 20 mm × 200 mm, ou frascos com capacidade similar e multipipeta de 8 canais, ajustável ou predefinida, ou qualquer outro sistema adequado para medir e distribuir 200 μL por poço.

Incluir ainda as ponteiras estéreis para multipipeta e uma aparelhagem para filtração por membrana de acordo com a ISO 8199, incluindo membranas filtrantes com porosidade de tamanho 0,2 μm, para esterilização do meio líquido. Disponibilizar as placas de microtitulação estéreis, 96 poços, 350 μL, com fundo plano, não fluorescente e tiras de cobertura adesivas estéreis para selar as placas de microtitulação, além de placas de Petri estéreis, com 90 mm de diâmetro.

Para a amostragem, retirar as amostras e entregá-las ao laboratório de acordo com as ISO 8199 e ISO 5667-1, ISO 5667-2 e ISO 5667-3. Para garantir resultados reproduzíveis, preparar o meio de cultura e os diluentes, usando constituintes de qualidade uniforme e produtos químicos de grau analítico reconhecido, ou um diluente desidratado ou meio completo preparado de acordo com as instruções do fabricante. Prepará-los com água desmineralizada ou destilada, isenta de substâncias capazes de inibir o crescimento nas condições de ensaio.

Se o meio não for usado imediatamente, conservá-lo no escuro em (5 ± 3) °C por até um mês, em condições que evitem quaisquer alterações em sua composição. O uso de produtos químicos de outros graus é permitido, desde que eles sejam de desempenho equivalente no ensaio. Como diluentes, diluente especial (DE), sal marinho sintético) 22,5 g, solução de azul de bromofenol (opcional) 10 mL, água desmineralizada ou destilada (7.2.2) 1 000 mL.

Esterilizar na autoclave (5.1) a 121 °C ± 3 °C, por 15 min a 20 min. A solução de azul de bromofenol é preparada adicionando 0,04 g em 100 mL de etanol a 50 %. É usado apenas para colorir o azul DE e para evitar confundi-lo com água desmineralizada ou destilada.

Água desmineralizada ou destilada isenta de substâncias inibidoras do crescimento nas condições de ensaio. Esterilizar na autoclave a 121 °C ± 3 °C, por 15 min a 20 min.

Como meio de cultura: meio MUG/EC, composição: triptona 40 g, salicina 1 g. Triton X 100® 1 g, MUG (4-metilumbeliferil-1-D-glucuronídeo) 100 mg e água desmineralizada ou destilada (7.2.2) 1 000 mL. Adicionar, sucessivamente, triptona, salicina e Triton a 1 L de água, mantendo um calor suave e agitação magnética, e deixar ferver até dissolver completamente. Deixar esfriar e adicionar o constituinte fluorogênico MUG, dissolvido em 2 mL de N, N-dimetilformamida.

A N, N-dimetilformamida é tóxica e pode causar câncer. Nociva por inalação, contato com a pele e ingestão. Usar em uma capela de exaustão de produtos químicos. Ajustar o pH para 6,9 ± 0,2. Esterilizar por filtração com membranas de tamanho médio de poro de 0,2 μm (5.10).

Distribuir em placas de microtitulação de 96 poços com um volume de 100 μL de meio em cada poço (capacidade mínima de 350 μL) e desidratar imediatamente em secador de túnel ou cabine de fluxo laminar. A fabricação do meio deve atender aos critérios de qualidade dados no Anexo E. Para o procedimento, na escolha de diluições, o número de diluições a inocular varia de acordo com o nível presumido de contaminação da água a ser ensaiada. A tabela abaixo fornece exemplos.

 

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Para a preparação de diluições, convém que estes procedimentos sejam realizados em cabine de segurança biológica, pois aerossóis podem ser gerados pela diluição e pipetagem. Água doce e salobra (residual) (salinidade < 30 g/kg, medida com um refratômetro (5.5) ou método equivalente). Preparar o número pertinente de tubos estéreis (5.7) em um rack, de acordo com o número de diluições selecionadas; adicionar 9 mL do diluente especial (7.2.1) a cada tubo.

Agitar vigorosamente a amostra (Seção 6), a fim de obter uma distribuição homogênea dos microrganismos e, com uma pipeta estéril, transferir imediatamente 9 mL desta amostra homogeneizada para o primeiro tubo contendo 9 mL de diluente (diluição 1/2). Utilizando uma nova pipeta, transferir 1 mL desta diluição (homogeneizada) para o segundo tubo (diluição 1/20).

A partir do segundo tubo (diluição 1/20, cuidadosamente homogeneizada), proceder, se necessário, a outra diluição 1/10, produzindo a diluição 1/200. Continuar da mesma forma até que todas as diluições tenham sido preparadas.

Para a água-marinha (salinidade ≥ 30 g/kg), preparar a quantidade pertinente de tubos estéreis em uma estante de tubos, de acordo com o número de diluições selecionadas; adicionar 9 mL de água desmineralizada/deionizada ou destilada ao primeiro tubo e 9 mL do diluente especial aos demais tubos. Agitar vigorosamente a amostra (Seção 6), a fim de obter uma distribuição homogênea dos microrganismos e, utilizando uma pipeta estéril, transferir imediatamente 9 mL desta amostra homogeneizada ao primeiro tubo contendo 9 mL de diluente (7.2.2) (diluição 1/2).

Utilizando uma nova pipeta, transferir 1 mL desta diluição (homogeneizada) para o segundo tubo (diluição 1/20). A partir do segundo tubo (diluição 1/20, cuidadosamente homogeneizada), proceder, se necessário, a outra diluição 1/10, produzindo a diluição 1/200. Continuar da mesma forma até que todas as diluições tenham sido preparadas.

Para a inoculação e incubação de placas para microtitulação, transferir o conteúdo do primeiro tubo de diluição para uma placa de Petri de 90 mm, estéril e vazia. Utilizando uma pipeta multicanais (5.8) com oito ponteiras estéreis (5.9), distribuir 200 μL em cada poço da placa para microtitulação (5.11), correspondente a esta primeira diluição. Para as diluições subsequentes (1/20, 1/200 etc.) operar de modo idêntico, trocando a placa de Petri e a linha de oito ponteiras estéreis entre cada diluição.

FONTE: Equipe Target

Baseado nos documentos visitados

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