17/03/2021 - Equipe Target
NBR ISO 20395 de 02/2021 - Biotecnologia - Requisitos para avaliação do desempenho dos métodos de quantificação para sequências-alvo de ácidos nucleicos - qPCR e dPCR
A NBR ISO 20395 de 02/2021 - Biotecnologia - Requisitos para avaliação do desempenho dos métodos de quantificação para sequências-alvo de ácidos nucleicos - qPCR e dPCR fornece os requisitos gerais para avaliar o desempenho e assegurar a qualidade dos métodos utilizados para a quantificação de sequências específicas de ácidos nucleicos (alvos). É aplicável à quantificação de sequências-alvo de DNA (ácido desoxirribonucleico) e de RNA (ácido ribonucleico), utilizando as tecnologias de amplificação por PCR digital (dPCR) ou por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Aplica-se às sequências-alvo presentes em moléculas de ácido nucleico, incluindo DNA de fita dupla (dsDNA), como DNA genômico (gDNA) e DNA plasmidial, DNA de fita simples (ssDNA), DNA complementar (cDNA) e RNA de fita simples (ssRNA), incluindo RNA ribossômico (rRNA), RNA mensageiro (mRNA) e RNA não codificante longo e curto [microRNA (miRNA) e RNA de interferência curtos (siRNA)], bem como RNA de fita dupla (dsRNA).
Aplica-se aos ácidos nucleicos derivados de fontes biológicas, como vírus, células procarióticas e eucarióticas, fluidos biológicos livres de células (por exemplo, plasma ou meio de cultura) ou de fontes in vitro (por exemplo, oligonucleotídeos, construções gênicas sintéticas e RNA transcrito in vitro). Não é aplicável à quantificação de oligonucleotídeos de DNA muito curtos (<50 bases).
Abrange o projeto analítico, incluindo estratégias de quantificação (quantificação do número de cópias de ácidos nucleicos utilizando uma curva de calibração como na PCR ou por meio de contagem molecular como na dPCR, quantificação relativa para uma amostra independente e medições de razão) e uso de controles; a quantificação da concentração mássica total de ácido nucleico e controle da qualidade de uma amostra de ácido nucleico, incluindo a avaliação da qualidade do ácido nucleico (pureza e integridade); o desenho do ensaio da PCR, otimização, testes de especificidade in silico e in vitro; o controle e análise da qualidade dos dados, incluindo critérios de aceitação, estabelecimento de threshold e normalização; a validação de método (precisão, linearidade, limite de quantificação, limite de detecção, exatidão e robustez), com requisitos específicos para qPCR e dPCR; as abordagens para estabelecer a rastreabilidade metrológica e estimar a incerteza de medição.
Este documento não fornece os requisitos ou critérios de aceitação para a amostragem de materiais biológicos ou para o processamento de amostras biológicas (ou seja, coleta, preservação, transporte, armazenamento, tratamento e extração de ácidos nucleicos). Também não fornece os requisitos e critérios de aceitação para aplicações específicas (por exemplo, aplicações em alimentos ou clínica em que problemas específicos da matriz podem surgir).
Target Genius Respostas Diretas:Como deve ser feita a determinação da razão entre dois alvos por dPCR?
Por que o método de qPCR ou dPCR deve ter os controles corretos?
