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NBR ISO 6888-3 de 01/2017: enumeração e detecção de estafilococos em alimentos

Quais os critérios do teste de desempenho do caldo Giolitti e Cantoni modificado? Como deve ser feito o repique dos tubos? Como deve ser feita a pontuação do teste de reação de coagulase? O que deve especificar o relatório de ensaio? Essas questões estão sendo apresentadas no texto sobre a enumeração e detecção de estafilococos em alimentos.

01/02/2017 - Equipe Target

A microbiologia de alimentos para consumo humano e animal

A NBR ISO 6888-3 de 01/2017 - Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal — Método horizontal para enumeração de estafilococos coagulase positiva (Staphylococcus Aureus e outras espécies) - Parte 3: Detecção e técnica por NMP para baixos números especifica um método horizontal para enumeração e detecção de estafilococos coagulase positiva, usando a técnica de número mais provável (NMP). Aplica-se a: produtos destinados ao consumo humano e animal, e amostras de ambientes das áreas de produção e manuseio de alimentos.

Este método é recomendado para produtos onde é esperado que estafilococos estejam sob estresse e em baixos números, como por exemplo, em produtos secos. Estafilococos coagulase positiva são principalmente Staphylococcus Aureus, mas Staphylococcus Intermedius e algumas cepas de Staphylococcus Hyicus também produzem coagulase.

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Quais os critérios do teste de desempenho do caldo Giolitti e Cantoni modificado?

Como deve ser feito o repique dos tubos?

Como deve ser feita a pontuação do teste de reação de coagulase?

O que deve especificar o relatório de ensaio?

A NBR 6888, sob o título geral “Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal – Método horizontal para enumeração de estafilococos coagulase positiva (Staphylococcus Aureus e outras espécies)”, tem a previsão de conter as seguintes partes: Parte 1: Técnica usando ágar Baird-Parker; Parte 2: Técnica usando meio ágar fibrinogênio plasma de coelho; e Parte 3: Detecção e técnica por NMP para baixos números. Devido à grande variedade de alimentos destinados ao consumo humano e animal, este método horizontal pode não ser apropriado em todos os detalhes para alguns produtos. Nestes casos, diferentes métodos, que são específicos para estes produtos, podem ser usados se absolutamente necessários por razões técnicas justificadas. No entanto, convém que toda tentativa seja feita para a aplicação deste método horizontal, sempre que possível. Quando esta Parte da NBR ISO 6888 for analisada criticamente, serão consideradas todas as informações então disponíveis relativas à aplicação deste método horizontal e as razões para desvios deste método no caso de produtos específicos.

A harmonização de métodos de ensaio pode não ser imediata, e para certos grupos de produtos podem já existir normas internacionais e/ou nacionais que não atendam a este método horizontal. Espera-se que, na análise crítica de tais normas, sejam feitas alterações em conformidade com esta Parte da NBR ISO 6888, de modo que, eventualmente, as únicas modificações deste método horizontal sejam aqueles necessários por razões técnicas bem fundamentadas.

Pode-se definir os estafilococos coagulase positiva como bactérias que formam colônias típicas e/ou atípicas na superfície de meio de cultura seletivo e que mostram reação positiva na prova da coagulase, ou uma reação específica ao fibrinogênio plasma de coelho no meio ágar fibrinogênio plasma de coelho. Para o propósito desta Parte da NBR ISO 6888, a confirmação de estafilococos coagulase positiva é baseada em uma reação fortemente positiva, mas é reconhecido que algumas cepas de estafilococos coagulase positiva produzem uma reação de coagulase fracamente positiva. Estas últimas cepas podem ser confundidas com outras bactérias, mas podem ser distinguidas destas outras bactérias pelo uso de testes adicionais como a produção de termonuclease (para detalhes, ver IDF 83).

Um meio de cultura seletivo é inoculado com uma quantidade específica da amostra de ensaio se o produto inicial for líquido, ou uma quantidade específica da suspensão inicial, no caso de outros produtos. Os tubos são incubados a 37 °C, anaerobicamente, por 24 h e 48 h. A presença de estafilococos coagulase positiva presuntivos é indicada pela redução do telurito de potássio.

Nesta Parte da NBR ISO 6888, anaerobiose é obtida vertendo um tampão de ágar ou parafina em cada tubo, mas um procedimento alternativo é incubar os tubos em uma jarra ou em uma incubadora sob condições de anaerobiose. A superfície do meio sólido seletivo ágar Baird Parker é inoculada a partir dos tubos positivos presuntivos (4.1.2) após 24 h e todos os tubos remanescentes após 48 h.

As placas são incubadas a 37 °C por 24 h e 48 h. A presença de estafilococos coagulase positiva presuntiva é indicada pela redução do telurito de potássio e por reação à gema de ovo. Colônias típicas e/ou atípicas são confirmadas por reação de coagulase. Alternativamente, a superfície de ágar fibrinogênio plasma de coelho pode ser inoculada e, após incubação apropriada, a presença de estafilococos coagulase positiva é indicada pelo aparecimento de colônias que apresentem reação específica ao fibrinogênio do plasma de coelho.

Os resultados são relatados como “presença” ou “ausência” de estafilococos coagulase positiva em x g ou x mL de produto. Para o método de enumeração, as diluições seriadas do produto são inoculadas em um meio de cultura líquido seletivo. Os tubos são incubados a 37 °C, anaerobicamente, por 24 h e 48 h. A presença de estafilococos coagulase positiva é indicada pela redução do telurito de potássio.

Nesta Parte da NBR ISO 6888, anaerobiose é obtida vertendo um tampão de ágar ou parafina em cada tubo, mas um procedimento alternativo é incubar os tubos em uma jarra ou em uma incubadora sob condições de anaerobiose. A superfície do meio sólido seletivo Baird-Parker é inoculada a partir dos tubos positivos presuntivos (4.2.2) após 24 h, e com todos os tubos remanescentes, após 48 h.

As placas são incubadas a 37 °C por 24 h e 48 h. A presença de estafilococos coagulase positiva presuntiva é indicada pela redução do telurito de potássio e por reação à gema de ovo. Colônias típicas e/ou atípicas são confirmadas por reação de coagulase. Alternativamente, a superfície de ágar fibrinogênio plasma de coelho pode ser inoculada e, após incubação apropriada, a presença de estafilococos coagulase positiva é indicada pelo aparecimento de colônias que apresentem reação específica ao fibrinogênio do plasma de coelho. O número mais provável de estafilococos coagulase positiva por grama ou por mililitro da amostra é calculado utilizando como referência à tabela de número mais provável para as diluições confirmadas (4.2.5 ou 4.2.6).

Para a preparação do Caldo Giolitti e Cantoni modificado, dissolver os ingredientes em água, por aquecimento e agitação, se necessário, até se obter completa dissolução. Resfriar a temperatura ambiente e ajustar o pH, se necessário, de modo que após a esterilização o pH final seja 6,9 ± 0,2. Dispensar o meio, em quantidades apropriadas, em tubos com dimensões adequadas (por exemplo, 16 mm × 160 mm, no caso do meio com concentração simples e 20 mm × 200 mm, no caso do meio com concentração dupla).

Para a alíquota de ensaio e suspensão inicial, ver a parte apropriada da ISO 6887 dependendo do produto em questão, ou ISO 8261. Adicionar 1 mL da suspensão inicial em 9 mL de caldo Giolitti e Cantoni (5.2) modificado com concentração simples (ou seja, 0,1 g ou 0,1 mL da amostra) ou 10 mL da suspensão inicial em 10 mL de caldo Giolitti e Cantoni modificado com concentração dupla (ou seja, 1 g ou 1 mL da amostra).

Para volumes maiores das porções de ensaio, preparar uma suspensão inicial adicionando x mL ou x g da alíquota de ensaio em 9x mL do diluente (ver ISO 6887 ou ISO 8261). Então, adicionar toda a suspensão inicial em 90x mL de caldo Giolitti e Cantoni modificado com concentração simples, previamente desaerado e adicionado de telurito de potássio. Deve haver um volume mínimo de ar no tubo ou frasco (por exemplo, adicionar 5 mL ou 5 g da amostra em 45 mL de diluente e adicionar toda a suspensão inicial em 450 mL de caldo Giolitti e Cantoni modificado com concentração simples). Cuidadosamente despejar um tampão de ágar (5.3) ou parafina, resfriados entre 44 °C e 47 °C, no topo do meio e permitir que solidifique para formar um selo.

Para o método de enumeração, alíquota de ensaio e suspensão inicial, tomar três tubos de caldo com concentração dupla, desaerados e adicionados de telurito de potássio (5.2.3). Transferir, para cada um destes tubos, 10 mL da amostra de ensaio para produtos líquidos ou 10 mL da primeira diluição (ou seja, 1 g da amostra) para outros produtos. Tomar três tubos de caldo com concentração simples, desaerados e adicionados de telurito de potássio (5.2.3). Transferir, para cada um destes tubos, 1 mL da amostra de ensaio para produtos líquidos ou 1 mL da primeira diluição (ou seja, 0,1 g da amostra) para outros produtos.

Para cada uma das diluições subsequentes, (ou seja, 10-1, 10-2, 10-3 para produtos líquidos ou 10-2, 10-3, 10-4 para outros produtos) proceder como especificado anteriormente, usando, para cada diluição, pipeta recentemente esterilizada. Preparar um número suficiente de diluições para garantir que a diluição final seja suficiente para gerar três resultados negativos. Cuidadosamente misturar o inóculo e o meio, evitando a introdução de ar. Cuidadosamente despejar um tampão de ágar (5.3) ou parafina, resfriados entre 44 °C e 47 °C, no topo do meio e permitir que solidifique para formar um selo.

FONTE: Equipe Target

Baseado nos documentos visitados

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